探索微观世界：显微摄影技术

显微摄影，也称为显微照相术，是一门捕捉肉眼无法看到的微小物体的图像的艺术和科学。它弥合了微观世界和我们的宏观理解之间的差距，揭示了原本无法看到的复杂细节和结构。本指南探讨了显微摄影中涉及的各种技术，面向初学者和经验丰富的从业者。

1. 了解基础知识

1.1 什么是显微摄影？

显微摄影涉及使用显微镜放大标本，然后使用相机捕捉该放大标本的图像。它是一种强大的工具，用于包括生物学、医学、材料科学和法医学在内的各个领域。

1.2 主要组成部分

显微摄影系统的基本组成部分包括：

• 显微镜：系统的基础，提供观察微观细节所需的放大倍数。存在不同类型的显微镜，每种显微镜都有其自身的优点和局限性（参见第 2 节）。
• 物镜：负责放大标本的主要镜头。物镜的特点是其放大倍数、数值孔径 (NA) 和工作距离。
• 目镜（接目镜）：进一步放大物镜形成的图像。
• 相机：捕捉图像。数码相机现在是标准配置，具有灵活性和易用性。
• 光源：为观察标本提供照明。光源的类型会显着影响图像质量和对比度。
• 标本制备：适当的标本制备对于获得高质量的图像至关重要。这包括染色、封片和切片。

2. 显微镜的类型

显微镜的选择取决于要观察的标本和所需的细节水平。以下是常见类型的概述：

2.1 光学显微镜

光学显微镜使用可见光来照明和放大标本。它们相对便宜且易于使用，使其成为教育和常规应用的理想选择。

2.1.1 明场显微镜

最基本的显微镜类型，其中标本从下方照明，图像是通过标本对光的吸收形成的。许多标本需要染色。

2.1.2 暗场显微镜

一种用倾斜光照明标本的技术，产生黑暗的背景并突出标本的边缘和细节。可用于观察未染色的标本，例如细菌。

2.1.3 相差显微镜

通过将折射率的差异转换为光强度的变化来增强透明标本的对比度。非常适合观察活细胞和组织。

2.1.4 差分干涉对比 (DIC) 显微镜

类似于相差，但提供类似 3D 的外观和更高的分辨率。也称为 Nomarski 显微镜。

2.1.5 荧光显微镜

使用荧光染料（荧光团）标记标本内的特定结构。标本用特定波长的光照射，这会激发荧光团，使其在更长的波长下发光。对于研究细胞过程和识别特定分子至关重要。

2.2 电子显微镜

电子显微镜使用电子束代替光来创建高度放大的图像。它们提供比光学显微镜高得多的分辨率，从而可以可视化亚细胞结构甚至单个分子。

2.2.1 透射电子显微镜 (TEM)

电子穿过非常薄的标本，根据不同区域的电子密度创建图像。需要大量的标本制备，包括固定、包埋和切片。

2.2.2 扫描电子显微镜 (SEM)

一束电子扫描标本表面，根据散射回来的电子创建图像。提供标本表面的 3D 视图。

2.3 共聚焦显微镜

一种荧光显微镜，它使用针孔来消除焦外的光，从而产生更清晰的图像，并能够创建厚标本的 3D 重建。广泛用于细胞生物学和发育生物学。

3. 标本制备技术

适当的标本制备对于获得高质量的显微图像至关重要。所使用的具体技术将根据标本的类型和所使用的显微镜类型而有所不同。

3.1 固定

通过交联蛋白质和其他分子来保持标本的结构。常见的固定剂包括甲醛和戊二醛。

3.2 包埋

涉及用支持介质（例如石蜡或树脂）浸润标本，以在切片过程中提供结构支撑。

3.3 切片

使用切片机将包埋的标本切割成薄片（切片）。对于光学显微镜，切片通常为几微米厚，对于电子显微镜，切片则薄得多。

3.4 染色

通过选择性地着色不同的结构来增强标本的对比度。有许多可用的染色剂，每种染色剂对不同的细胞成分具有不同的亲和力。示例包括用于一般组织染色的苏木精和伊红 (H&E)，以及用于特定标记的荧光染料。

3.5 封片

将制备好的标本放在玻璃载玻片上，并用盖玻片覆盖。使用封片剂将盖玻片粘附到载玻片上，并防止标本干燥。

4. 照明技术

所使用的照明类型会显着影响显微图像的质量和对比度。不同的技术适用于不同的标本和显微镜。

4.1 柯勒照明

一种提供均匀和明亮标本照明的技术。它涉及调整聚光镜孔径和视场光阑以优化光路。柯勒照明对于在明场显微镜中获得高质量的图像至关重要。

4.2 透射光照明

光从下方穿过标本。用于明场、暗场、相差和 DIC 显微镜。

4.3 反射光照明

光从上方照射到标本上。用于荧光显微镜和某些类型的金相显微镜。

4.4 斜照明

光以一定角度照射到标本上，产生阴影并增强表面特征的对比度。用于暗场显微镜和某些类型的反射光显微镜。

5. 数字成像和图像处理

数码相机彻底改变了显微摄影，提供了高分辨率图像，并允许轻松进行图像处理和分析。

5.1 相机选择

选择合适的相机对于获得高质量的图像至关重要。需要考虑的因素包括：

• 分辨率：图像传感器中的像素数量，它决定了可以捕获的细节级别。
• 传感器尺寸：较大的传感器通常提供更好的图像质量和更低的噪声。
• 像素大小：较小的像素可以捕获更多细节，但也更容易受到噪声的影响。
• 帧率：每秒可以捕获的图像数量。对于捕获动态事件很重要。
• 动态范围：相机可以捕获的光强度范围。

5.2 图像采集

适当的图像采集技术对于获得高质量的图像至关重要。这包括：

• 对焦：实现清晰对焦对于捕获精细细节至关重要。
• 曝光时间：调整曝光时间以适当照明标本。
• 增益：放大来自相机传感器的信号。使用过高的增益会引入噪声。
• 白平衡：校正图像中的色彩偏差。
• 图像堆叠：组合在不同焦平面拍摄的多个图像，以创建具有增加景深的图像。

5.3 图像处理

图像处理技术可用于增强显微图像的质量并提取定量数据。常见的图像处理技术包括：

• 对比度增强：调整图像的对比度和亮度以提高可见性。
• 锐化：增强图像中的边缘和细节。
• 降噪：减少图像中的噪声量。
• 色彩校正：校正图像中的色彩不平衡。
• 图像分割：分离图像中的不同对象或区域。
• 测量和分析：测量图像中对象的大小、形状和强度。软件示例包括 ImageJ、Fiji 和 Metamorph 等商业软件包。

6. 高级技术

除了基本技术之外，还可以使用几种高级方法来突破显微摄影的界限。

6.1 延时显微镜

随着时间的推移捕获一系列图像以观察动态过程，例如细胞分裂、迁移和分化。需要仔细控制温度、湿度和二氧化碳水平以维持细胞活力。

6.2 超分辨率显微镜

克服光的衍射极限的技术，允许可视化小于 200 nm 的结构。示例包括受激发射损耗 (STED) 显微镜、结构照明显微镜 (SIM) 和单分子定位显微镜 (SMLM)，例如 PALM 和 STORM。

6.3 光片显微镜

也称为选择性平面照明显微镜 (SPIM)，该技术使用薄片光来照射标本，最大限度地减少光毒性，并允许对活细胞和组织进行长期成像。广泛用于发育生物学和神经科学。

6.4 相关显微镜

结合不同的显微镜技术来获得关于相同标本的补充信息。例如，将光学显微镜与电子显微镜结合起来，以将细胞结构与分子事件相关联。

7. 解决常见问题

显微摄影可能具有挑战性，并且能够解决常见问题非常重要。

7.1 图像质量差

• 问题：图像模糊。解决方案：检查对焦，确保标本已正确安装，并使用稳定的显微镜支架。
• 问题：对比度低。解决方案：调整照明设置，使用适当的染色技术，或尝试不同的显微镜技术（例如，相差或 DIC）。
• 问题：噪声过大。解决方案：降低增益，增加曝光时间，或使用降噪算法。

7.2 伪影

• 问题：镜头上的灰尘颗粒或划痕。解决方案：使用镜头纸和适当的清洁溶液清洁物镜和聚光镜。
• 问题：封片剂中的气泡。解决方案：小心地重新安装标本以避免气泡。
• 问题：固定伪影。解决方案：优化固定协议以最大限度地减少组织收缩和变形。

8. 道德考量

在进行显微摄影时，尤其是在生物医学研究中，遵守道德准则至关重要。这包括适当的数据管理、避免歪曲数据的图像操作，以及在处理临床样本时确保患者的机密性。透明度和可重复性至关重要。

9. 案例研究和示例

为了说明显微摄影的实际应用，以下是一些示例：

• 医学诊断：对组织活检进行显微检查对于诊断癌症等疾病至关重要。染色技术和先进的显微镜方法有助于识别异常细胞和结构。
• 材料科学：分析材料的微观结构以了解其性能和性能。SEM 和 TEM 通常用于对晶界、缺陷和其他微观结构特征进行成像。
• 环境监测：识别和量化水和土壤样本中的微生物。荧光显微镜可用于检测特定污染物或病原体。
• 法医学：检查痕迹证据，例如纤维和毛发，以将嫌疑人与犯罪现场联系起来。显微摄影提供了可用于比较和识别的详细图像。例如，识别全球建筑材料中的石棉纤维。

10. 资源和进一步学习

有许多资源可供那些有兴趣了解更多关于显微摄影的人使用：

• 在线课程：Coursera、edX 和 Udemy 等平台提供关于显微镜和图像分析的课程。
• 研讨会和会议：显微镜学会和组织定期举办关于显微镜各个方面的研讨会和会议。
• 书籍：几本优秀的教科书涵盖了显微镜的理论和实践，包括 James Pawley 的《生物共聚焦显微镜手册》和 Alberts 等人的《细胞分子生物学》。
• 在线论坛和社区：在线论坛和社区，例如 Microscopy List 和 Bio-protocol，提供了一个分享知识和提出问题的平台。

11. 显微摄影的未来

在技术进步和对高分辨率成像日益增长的需求的推动下，显微摄影领域继续快速发展。新兴趋势包括：

• 人工智能 (AI)：AI 算法正被用于自动化图像分析、提高图像质量以及识别人类观察者可能遗漏的细微特征。
• 深度学习：训练神经网络以识别显微图像中的模式和分类对象。
• 3D 打印：3D 打印正被用于创建用于样品制备的定制显微镜组件和微流控设备。
• 虚拟现实 (VR)：VR 正被用于创建沉浸式环境，用于探索 3D 显微图像并与之交互。

结论

显微摄影是探索微观世界复杂细节的强大工具。通过了解显微镜的基础知识、掌握标本制备技术以及利用数字成像和图像处理工具，研究人员和爱好者都可以释放新的见解并取得突破性发现。无论您是经验丰富的显微镜学家还是刚刚起步，可能性都是无限的。请记住始终优先考虑道德行为，并在您的工作中力求透明。