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一份全面的显微摄影技术指南,涵盖从基本原理到高级方法的所有内容,适合初学者和经验丰富的显微镜学家。

探索微观世界:显微摄影技术

显微摄影,也称为显微照相术,是一门捕捉肉眼无法看到的微小物体的图像的艺术和科学。它弥合了微观世界和我们的宏观理解之间的差距,揭示了原本无法看到的复杂细节和结构。本指南探讨了显微摄影中涉及的各种技术,面向初学者和经验丰富的从业者。

1. 了解基础知识

1.1 什么是显微摄影?

显微摄影涉及使用显微镜放大标本,然后使用相机捕捉该放大标本的图像。它是一种强大的工具,用于包括生物学、医学、材料科学和法医学在内的各个领域。

1.2 主要组成部分

显微摄影系统的基本组成部分包括:

2. 显微镜的类型

显微镜的选择取决于要观察的标本和所需的细节水平。以下是常见类型的概述:

2.1 光学显微镜

光学显微镜使用可见光来照明和放大标本。它们相对便宜且易于使用,使其成为教育和常规应用的理想选择。

2.1.1 明场显微镜

最基本的显微镜类型,其中标本从下方照明,图像是通过标本对光的吸收形成的。许多标本需要染色。

2.1.2 暗场显微镜

一种用倾斜光照明标本的技术,产生黑暗的背景并突出标本的边缘和细节。可用于观察未染色的标本,例如细菌。

2.1.3 相差显微镜

通过将折射率的差异转换为光强度的变化来增强透明标本的对比度。非常适合观察活细胞和组织。

2.1.4 差分干涉对比 (DIC) 显微镜

类似于相差,但提供类似 3D 的外观和更高的分辨率。也称为 Nomarski 显微镜。

2.1.5 荧光显微镜

使用荧光染料(荧光团)标记标本内的特定结构。标本用特定波长的光照射,这会激发荧光团,使其在更长的波长下发光。对于研究细胞过程和识别特定分子至关重要。

2.2 电子显微镜

电子显微镜使用电子束代替光来创建高度放大的图像。它们提供比光学显微镜高得多的分辨率,从而可以可视化亚细胞结构甚至单个分子。

2.2.1 透射电子显微镜 (TEM)

电子穿过非常薄的标本,根据不同区域的电子密度创建图像。需要大量的标本制备,包括固定、包埋和切片。

2.2.2 扫描电子显微镜 (SEM)

一束电子扫描标本表面,根据散射回来的电子创建图像。提供标本表面的 3D 视图。

2.3 共聚焦显微镜

一种荧光显微镜,它使用针孔来消除焦外的光,从而产生更清晰的图像,并能够创建厚标本的 3D 重建。广泛用于细胞生物学和发育生物学。

3. 标本制备技术

适当的标本制备对于获得高质量的显微图像至关重要。所使用的具体技术将根据标本的类型和所使用的显微镜类型而有所不同。

3.1 固定

通过交联蛋白质和其他分子来保持标本的结构。常见的固定剂包括甲醛和戊二醛。

3.2 包埋

涉及用支持介质(例如石蜡或树脂)浸润标本,以在切片过程中提供结构支撑。

3.3 切片

使用切片机将包埋的标本切割成薄片(切片)。对于光学显微镜,切片通常为几微米厚,对于电子显微镜,切片则薄得多。

3.4 染色

通过选择性地着色不同的结构来增强标本的对比度。有许多可用的染色剂,每种染色剂对不同的细胞成分具有不同的亲和力。示例包括用于一般组织染色的苏木精和伊红 (H&E),以及用于特定标记的荧光染料。

3.5 封片

将制备好的标本放在玻璃载玻片上,并用盖玻片覆盖。使用封片剂将盖玻片粘附到载玻片上,并防止标本干燥。

4. 照明技术

所使用的照明类型会显着影响显微图像的质量和对比度。不同的技术适用于不同的标本和显微镜。

4.1 柯勒照明

一种提供均匀和明亮标本照明的技术。它涉及调整聚光镜孔径和视场光阑以优化光路。柯勒照明对于在明场显微镜中获得高质量的图像至关重要。

4.2 透射光照明

光从下方穿过标本。用于明场、暗场、相差和 DIC 显微镜。

4.3 反射光照明

光从上方照射到标本上。用于荧光显微镜和某些类型的金相显微镜。

4.4 斜照明

光以一定角度照射到标本上,产生阴影并增强表面特征的对比度。用于暗场显微镜和某些类型的反射光显微镜。

5. 数字成像和图像处理

数码相机彻底改变了显微摄影,提供了高分辨率图像,并允许轻松进行图像处理和分析。

5.1 相机选择

选择合适的相机对于获得高质量的图像至关重要。需要考虑的因素包括:

5.2 图像采集

适当的图像采集技术对于获得高质量的图像至关重要。这包括:

5.3 图像处理

图像处理技术可用于增强显微图像的质量并提取定量数据。常见的图像处理技术包括:

6. 高级技术

除了基本技术之外,还可以使用几种高级方法来突破显微摄影的界限。

6.1 延时显微镜

随着时间的推移捕获一系列图像以观察动态过程,例如细胞分裂、迁移和分化。需要仔细控制温度、湿度和二氧化碳水平以维持细胞活力。

6.2 超分辨率显微镜

克服光的衍射极限的技术,允许可视化小于 200 nm 的结构。示例包括受激发射损耗 (STED) 显微镜、结构照明显微镜 (SIM) 和单分子定位显微镜 (SMLM),例如 PALM 和 STORM。

6.3 光片显微镜

也称为选择性平面照明显微镜 (SPIM),该技术使用薄片光来照射标本,最大限度地减少光毒性,并允许对活细胞和组织进行长期成像。广泛用于发育生物学和神经科学。

6.4 相关显微镜

结合不同的显微镜技术来获得关于相同标本的补充信息。例如,将光学显微镜与电子显微镜结合起来,以将细胞结构与分子事件相关联。

7. 解决常见问题

显微摄影可能具有挑战性,并且能够解决常见问题非常重要。

7.1 图像质量差

7.2 伪影

8. 道德考量

在进行显微摄影时,尤其是在生物医学研究中,遵守道德准则至关重要。这包括适当的数据管理、避免歪曲数据的图像操作,以及在处理临床样本时确保患者的机密性。透明度和可重复性至关重要。

9. 案例研究和示例

为了说明显微摄影的实际应用,以下是一些示例:

10. 资源和进一步学习

有许多资源可供那些有兴趣了解更多关于显微摄影的人使用:

11. 显微摄影的未来

在技术进步和对高分辨率成像日益增长的需求的推动下,显微摄影领域继续快速发展。新兴趋势包括:

结论

显微摄影是探索微观世界复杂细节的强大工具。通过了解显微镜的基础知识、掌握标本制备技术以及利用数字成像和图像处理工具,研究人员和爱好者都可以释放新的见解并取得突破性发现。无论您是经验丰富的显微镜学家还是刚刚起步,可能性都是无限的。请记住始终优先考虑道德行为,并在您的工作中力求透明。